基因編輯 CRISPR/Cas9

“ CRISPR 並非第一種基因編輯的方式，但是是迄今為止「最精確」基因編輯的技術 ”

CRISPR為近年來發展的新興熱門技術，全名為群聚且有規律間隔的短回文重複序列」（clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats, CRISPR），其來自於細菌為抵禦病毒所發展出的免疫抵禦機制。目前已有3套CRISPR系統(I-III)被發現，TypeI、III 而最廣泛被使用作為基因編輯的為CRISPR Type II System，此套系統包含 nuclease Cas9, crRNA 以及tracrRNA，透過tracrRNA輔助crRNA到目標互補DNA序列上，Cas9進行雙股DNA斷裂(Double strand break, DSB)，進而達成基因敲除 (Knock-out) 編輯功能。科學家更進一步的將crRNA array以及tracrRNA結合成單一股 single-guide RNA (sgRNA)，使的CRISPR/Cas9系統更容易進行操作。

Figure : 20-nt sgRNA (藍色) 與scaffold (紅色) 引導 Cas9 nucleaes (黃色)到 genomic DNA 互補序列上，Cas9 nuclease 在5' NGG 序列 (PAM 粉紅色) 前方3個base pair進行專一性的DSB。 ref: nature protocols | VOL.8 NO.11 | 2013

ACE Biolabs 具有台灣CRISPR 專業團隊，提供設計gRNA的專業意見，並有多種gRNA plasmid可供選擇。引進高效率電轉染技術平台，以達到最高效率、最高細胞存活率、最低off - target的機率。

CRISPR 基因編輯服務特點

1. 嶄新三條gRNA進行DSB技術，提升目標準確率

2. 使用sgRNA+Cas9+Reporter 三合一質體，不需像傳統嘗試不同比例。

3. 運用高效率電轉染技術，縮短時程，提高成功率。

4. 全方面，各類型細胞皆可操作。

CRISPR 基因編輯服務流程

流程	項目	內容
接案	了解客戶需求簽訂服務委託書預付40%訂金與材料費
材料準備	細胞培養條件確認 (約 3 至 5 週)	檢測細胞黴漿菌汙染特異細胞株轉染條件確認。無參考資料，需測試轉染條件。
材料準備	Sp-gRNA建構 (約 3 至 5 週)	確認基因編輯的區塊。設計可以涵蓋該區塊的引子對，並確定PCR條件。建構2到3個Sp-gRNA表現載體，DNA定序確認Sp-gRNA expression cassettes。(0.5 mg/vector)
轉染Cas9和Sp-gRNA表現載體到指定細胞株	轉染Cas9和Sp-gRNA表現載體到指定細胞株後，以抗生素篩選。 (約 2 至 3 週)	收集總體細胞之gDNA，以PCR方法判定是否產生gene editing。 PCR products經TA cloning，做DNA序列分析。(Optional)
細胞株篩選	篩選標的基因兩個alleles均破壞的細胞株	收集細胞株之gDNA，以PCR方法判定判定兩個alleles均遭破壞。 PCR products經TA cloning，做DNA序列分析。(Optional)
細胞株再篩選	上述細胞株再經一次篩選	收集細胞株之gDNA，以PCR方法判定兩個alleles均遭破壞。
DNA序列分析	PCR products經TA cloning，做DNA序列分析	以DNA序列分析方式確認兩個alleles均遭破壞。
細胞培養至出貨規格	CRISPR KO Cell Line (2x10⁶ cell /tube)凍管一管
客戶使用檢測	請於一個月內測試細胞，並告知測試結果

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Catalog#	Name
ER1005	T7 Endonuclease I
ER1006	Cas9 Nuclease
ER1007	Cas9 D10A Nickase