Stem Cell | 臍帶間質幹細胞(UC-MSC)的原代培養 2021/01/06

臍帶間質幹細胞（Umbilical cord Mesenchymal Stem Cell）原代培養流程

1. 材料
2. 實驗前準備 - 培養瓶表面coating Cell Adhesion Enhancer ; 配製Human Mesenchymal Stem Cell Complete medium
3. 實驗方法
   A. 酵素分解組織，萃取幹細胞進行培養
   B. 組織塊貼覆培養瓶，收集爬出幹細胞進行培養

臍帶間質幹細胞 - 簡介

人類臍帶構造包含兩條臍動脈及一條臍靜脈如下圖所示，瓦頓氏膠 (Wharton's jelly, WJ) 指的是臍帶中動脈及靜脈之間的基質部分。分離來自瓦頓氏膠的間質幹細胞稱為臍帶間質幹細胞 (Umbilical cord Mesenchymal Stem Cell, UC-MSC)， 其與不同來源之間葉幹細胞如骨髓、脂肪、乳牙或臍帶血等來源的 MSCs一樣具有間質幹細胞的特性，例如: 自我更新、多重分化潛能，而 UC-MSC 更具有較易於分離與培養及體外增生速度較快的特性。

UC-MSC可利用酵素將其自臍帶基質中萃取出來，或是將瓦頓氏膠貼覆於培養瓶待幹細胞爬出，可以成功的在體外培養數代。UC-MSC經由表面抗原分析，具有CD45(-)、CD 34(-)、HLA c l a ss II (-) 、 C D 7 3 ( + ) 、 CD90(+) 、 CD105(+) 及 HLA ABC(+)之表現的間質幹細胞的特性。在體外試驗也可以成功的誘導分化成脂肪細胞、軟骨細胞、硬骨細胞等。 間質幹細胞多重分化潛能，不但改變了人們原先對於成體幹細胞，分化能力受限的看法，也大幅提升了 MSCs在 細 胞 療 法 (cell therapy)、 組織工程 (tissue engineering)、 及再生醫學 (regenerative medicine)等領域的研究與應用的價值。

https://stemcellsjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/sctm.16-0492

臍帶間質幹細胞 - 原代細胞培養

實驗材料

1. 材料：離體2 小時內的健康新生兒臍帶
2. 試劑：臍帶/組織保存液、Human Mesenchymal Stem Cell Culture Kit (Serum-Free)(ACE Biolabs SC-CM01)
3. 儀器：細胞培養瓶、無菌無塵操作台、自動CO2 恒溫培養箱、倒立生物顯微鏡、無菌不鏽鋼托盤、無菌鑷子、無菌藥匙、無菌燒杯、無菌手術剪、移液器、無菌移液管、微量無菌移液管、無菌培養瓶

實驗前準備

1. 配製Human Mesenchymal Stem Cell Complete medium :
   
   37℃環境下融化Human Mesenchymal Stem Cell Culture Supplement (Serum-Free)( ACE Biolabs SC-CM01B)，按10%比例加入基礎培養基Human Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (Serum-Free) ( ACE Biolabs SC-CM01A)中，充分混合均勻，即為完全培養基。
   
   建議完全培養基現用現配，1 周內用完。如培養體積小，建議根據實際使用量將Culture Supplement(SC-CM01B)分裝凍存使用，避免反覆凍融。
    
2. 培養瓶表面coating Cell Adhesion Enhancer

直接取適量的Cell Adhesion Enhancer 加在細胞培養瓶底部，輕輕搖動培養瓶使Cell Adhesion Enhancer均勻分佈，在CO₂培養箱中，37℃至少靜置60 min（或用保鮮膜包裹塗層的培養皿/瓶靜置2-8℃過夜），接種細胞/組織之前，去除多餘的試劑。

實驗方法

A. 酵素分離法

1. 在無菌操作台內，取出臍帶，放入平皿中，用PBS 反復清洗，棄上清。
2. 用剪刀和鑷子去掉臍帶動靜脈和表面羊膜，將組織塊剪碎。
3. 將組織塊放入離心管，加入適量的Collagenase,  Type Ⅳ。
4. 放入37℃中，震盪直至組織塊被消化成粘稠狀態（根據消化狀態可適當調整時間）。
5. 取出離心管，補加Complete medium至後離心，去掉一半的上清液，盡可能不要倒掉太多粘稠部分液體。
6. 再補加Complete medium至後離心，去掉一半的上清液，盡可能不要倒掉太多粘稠部分液體。
7. 補加Complete medium後，平均分到兩個 T75 cm² 培養瓶中，放入5% CO₂ 培養箱中進行培養。
   注意：觀察當瓶中底部已出現貼壁細胞，則去除上清中的殘留的組織塊或非貼壁細胞（可把這步中的上清倒進一個新瓶中繼續培養），原瓶換上新鮮的Complete medium。

B. 組織貼覆法

1. 在無菌操作台內，取出臍帶，放入平皿中，用PBS 反復清洗，棄上清。
2. 沿臍靜脈內腔縱向剪開臍帶，用齒鑷剝離臍靜脈內膜，將覆蓋動脈的瓦頓氏凝膠略微剝離，順勢抽出兩根動脈。剩餘部分主要為Wharton's Jelly 瓦頓氏膠。
3. 將瓦頓氏膠剪至黃豆大小的組織塊，用藥匙將組織塊放置於coating Cell Adhesion Enhancer的T175 cm² 細胞培養瓶中，維持組織塊間距、確認組織塊與培養瓶貼實，蓋好瓶蓋，置於無菌無塵操作台中，放置2 小時。
4. 將Complete medium 沿培養瓶瓶壁緩慢加入。Complete medium必須浸潤臍帶組織。
5. 將培養皿緩慢移動至37℃、5%CO₂ 培養箱中。
6. 放置在培養箱中的培養瓶，在前7 天內嚴禁移動。7 天後補充10ml Complete medium，換液時應緩慢操作，切勿沖起組織塊。
7. 自7 天后，觀察組織塊周圍是否有已爬出的幹細胞。
8. 去除組織塊後收集爬出的UC-MSC 細胞。