Western Blotting │ 如何降低蛋白質定量誤差

蛋白質定量時最常使用的試劑為 BCA Protein Assay 或是 Bradford Protein Assay，定量前除了詳閱操作手冊之外，使用蛋白質定量試劑時的操作手法、適合定量的範圍以及試劑適合的溶劑皆需特別注意，才能準確定量蛋白質降低誤差。

(一) 操作手法

下表整理了BCA Protein Assay 以及 Bradford 兩種方式在操作上的不同 :

	BCA Protein Assay	Bradford Protein Assay
所需時間	30 min , 37°C	5 min , RT
適用蛋白質濃度檢測區間	5-2000 μg/mL	1-125 μg/mL
吸光值	562 nm	595 nm
反應所需的sample量/well	25 μL	20 μL

從表中可以發現在定量所需時間的長短相差很多，BCA Protein Assay 需要反應時間為30分鐘且要在37°C的環境下進行，而Bradford Protein Assay 則是只需要5分鐘，如此短的反應時間確實十分方便，也因此很多實驗室都選擇Bradford Protein Assay 這個更簡單的方法，但如此短的反應時間也因此在操作上的誤差相對於BCA Protein Assay 更大，因為只要一滴入試劑，便會與蛋白開始反應，容易導致在陸續將Bradford Protein Assay試劑滴入蛋白 Sample的時候，先滴入的 Sample反應比後滴入的 Sample反應時間長，可能過度反應，導致最後測出的吸光度結果比應有的吸光度更高使得誤差值提升，尤其在蛋白濃度較高的Sample，這種狀況更為明顯，越是濃度高的蛋白，越容易在用 Bradford Protein Assay 定量時有越大的誤差。

另外由於Bradford Protein Assay 的快速反應，在配置蛋白質定量的標準曲線時，尤其要特別注意的一點是，蛋白質標準品必需要由低濃度網高濃度測定，避免標準曲線偏差而造成定量上的誤差。

(二) 適合定量的範圍

由BCA Protein Assay 適用蛋白質濃度檢測區間為5-2000 μg/mL，Bradford Protein Assay 適用蛋白質濃度檢測區間為1-125 μg/mL。大多實驗室會以經驗法則預估待測樣品的蛋白濃度是否落在檢測區間。若是未知樣品，則建議使用蛋白質濃度檢測區間較廣的BCA Protein Assay 。

(三) 蛋白質定量試劑干擾物

用於萃取蛋白質的RIPA buffer中，成份含有緩衝液、鹽類、以及界面活性劑。Bradford Protein Assay 試劑容易受到RIPA buffer中的界面活性劑干擾而造成誤差。（參考本文最後附表）

以下以同樣的蛋白質樣本中帶有不同濃度的Triton X-100作為變因進行實驗，確認是否會影響定量的準確度，結果如下表 :

	BCA Protein Assay (µg/ml)	Bradford Protein Assay (µg/ml)
0.1% Triton X-100	143.938	176.588
1% Triton X-100	120.214	61.308
3% Triton X-100	121.643	255.923
5% Triton X-100	172.357	346.692

由結果可得知Triton-X 100 對於Bradford Protein Assay 影響較大，BCA Protein Assay 可以容忍較高的 Triton-X 100 濃度。在超過Bradford Protein Assay 所能承受的極限之上的濃度，會使得一加入試劑便立刻進行反應變色，使得在測定的時候，幾乎都是過度反應甚至有沉澱發生，導致數值誤差，影響蛋白質濃度定量的結果。

總結

要得到準確蛋白質定量數據，建議您注意以下事項：

配置標準曲線時，先由低濃度標準品開始加入蛋白質定量試劑。避免高濃度標準品與試劑過度反應而造成標準曲線偏差。
欲定量的蛋白樣品數多寡。使用Bradford Protein Assay 定量時，建議將樣品數控制在2分鐘內可以上樣完畢的數量。也就是說第一個蛋白樣品與Bradford reagent 混合與最後一個蛋白樣品與Bradford reagent 混合的時間差，控制在2分鐘內。若是樣品數過多，可分次定量或是使用 BCA Protein Assay。
欲定量的蛋白是存在於何種緩衝液配方中，緩衝液中各成分的含量是否超過蛋白質定量試劑可容忍的範圍內（參考以下附表）。若緩衝液中的成分含量超過可容忍的範圍內，建議用水稀釋到可容忍的範圍內再做定量。同時要注意的是，確認稀釋後的蛋白濃度是否還落在蛋白質定量試劑可偵測的範圍內。
蛋白濃度是否落在蛋白質定量試劑可偵測的範圍內。Bradford Protein Assay 的檢測區間建議在1-125 μg/mL; BCA Protein Assay的檢測區間建議在5-2000 μg/mL。

附表一：BCA以及 Bradford 兩種方式對於各項鹽類、Buffer以及Detergents的可容忍的範圍

	BCA Protein Assay	Bradford Protein Assay
Salts/Buffers
ACES, pH 7.8	25 mM	100 mM
Ammonium sulfate	1.5 M	1 M
Asparagine	1 mM	10 mM
Bicine, pH 8.4	20 mM	100 mM
Bis-Tris, pH 6.5	33 mM	100 mM
Borate, pH 9.5	50 mM	50 mM
Calcium chloride in TBS, pH 7.2	10 mM	10 mM
Cesium bicarbonate	100 mM	100 mM
HEPES, pH 7.5	100 mM	100 mM
Imidazole, pH 7.0	50 mM	200 mM
PBS; Phosphate (0.1 M), NaCl (0.15 M), pH 7.2	undiluted	undiluted
PIPES, pH 6.8	100 mM	100 mM
RIPA lysis buffer; 50mM Tris, 150mM NaCl, 0.5% DOC, 1% NP-40, 0.1% SDS, pH 8.0	undiluted	1/10 dilution
Sodium acetate, pH 4.8	200 mM	180 mM
Sodium azide	0.20%	0.50%
Sodium bicarbonate	100 mM	100 mM
Sodium chloride	1 M	5 M
Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4	200 mM	200 mM
Sodium phosphate	100 mM	100 mM
Tris	250 mM	2 M
TBS; Tris (25mM), NaCl (0.15 M), pH 7.6	undiluted	undiluted
Tris (25mM), Glycine (192mM), pH 8.0	1:3 diluted	undiluted
Chelating agents
EDTA	10 mM	100 mM
Detergents
Brij-35	5.00%	0.12%
Brij-56, Brij-58	1.00%	0.03%
CHAPS, CHAPSO	5.00%	5.00%
Deoxycholic acid	5.00%	0.05%
Octyl β-glucoside	5.00%	0.05%
Nonidet P-40 (NP-40)	5.00%	0.05%
Octyl β-thioglucopyranoside	5.00%	3.00%
SDS	5.00%	0.12%
Triton X-100	5.00%	0.12%
Triton X-114	1.00%	0.12%
Triton X-305, X-405	1.00%	0.50%
Tween-20, Tween-60, Tween-80	5.00%	0.06%
Zwittergent 3-14	1.00%	0.02%