Western Blotting │ Blocking Buffer 種類及選用

在進行Western Blot的實驗時，常常最令人頭痛的並不是目標蛋白染不出來，而是除了目標蛋白之外，在很多非目標蛋白的位置皆有訊號，甚至是空白區域也會有背景過高的問題，而造成以上狀況的原因固然有抗體專一性不夠強的可能，但其實更多時候，是選用的Blocking Buffer不適合所導致的結果。想要跑出一張漂亮的Western blot結果，就絕對不能小看Blocking這個步驟在其中扮演的角色。

Western Blot的實驗中，遇到背景過高的問題，可以先參考先前文章【Western blotting | 背景過高問題】，本篇文章著重於介紹 Blocking Buffer 種類成份及適用範圍，選擇 Blocking Buffer 時不妨多一層思考，使用較適合的 Blocking Buffer，省去之後trouble-shooting 的時間。

~Blocking Buffer 分類~

在轉印膜上除了樣品的目標蛋白質之外，還會有許多空白的區域，而Blocking 這個步驟就是為了要封閉這些空白區域，以此防止抗體透過非專一性結合到轉印膜上，造成背景雜訊的增加。因此我們可以透過調整不同配方的Blocking buffer來達到降低背景訊號的目的。而在市面上常作為 Western Blot 實驗中使用的 Blocking buffer 主要以成分中是否含有蛋白質作為分別分成兩大類 :

~Protein-based Blocking Buffer~

一般實驗中常使用的脫脂奶粉便是含有蛋白質的Blocking buffer中最為人所知的，由於脫脂奶粉成本非常低，而其中的酪蛋白成分可以達到Blocking的效果，因此有很多實驗室會選用脫脂奶粉作為Blocking buffer，但缺點是由於成分複雜且內含牛 IgG，因此anti-goat 二級抗體可能辨認牛 IgG，造成高背景。且當偵測磷酸化蛋白質時也容易因為牛奶內含磷酸化蛋白質而造成干擾導致訊號低及高背景。而除了牛奶之外，含有蛋白質的blocking buffer還有Bovine serum albumin ( BSA )、Fish gelatin以及Casein ( 酪蛋白 ) : BSA比起脫脂奶粉，很適合運用於偵測磷酸化蛋白質，但在遇到成分稍複雜的樣品一樣容易有高背景；由冷水魚( Cold-water fish )的皮膚純化出的Fish gelatin由於不含任何血清蛋白質，因此可以減少背景干擾，但因其含內生性 biotin 所以不能使用在 biotin 偵測系統；Casein ( 酪蛋白 )則是優化脫脂奶粉而形成的 Blocking buffer，成分變得單純，因此較不會有高背景的問題，但同樣不適合在偵測磷酸蛋白質時使用。

~Protein-Free Blocking Buffer~

由於含有蛋白質的 Blocking buffer 容易在 Blocking 的時候與蛋白質交叉反應導致背景的提高，因此在選用 Blocking buffer 時也有不含蛋白質的 Blocking buffer 可供選擇，或稱為 Protein-Free Blocking Buffer，無蛋白質的 Blocking buffer 主要有兩種類型的成分，一種為碳氫化合物，包含-CHn 、-C6H5，主要是以疏水性作用力結合轉印膜，以此覆蓋在膜上的空白區域；而另一種則是使用Polyvinylpyrrolidone ( PVP )作為主要成分，PVP 是一種水溶性的polymer，可以快速鍵結到轉印膜上覆蓋膜上的空白區域，由於其成分不含有蛋白質，因此可以避免blocking buffer 與蛋白樣品之間的相互作用，比起含蛋白質的blocking buffer較易出現特定信號以及較低的背景訊號。

~Blocking Buffer 選用~

根據不同的實驗樣品，選擇最適合的Blocking buffer，可以有效讓實驗事半功倍，讓Western Blot更容易呈現好的結果。

ACE Biolabs 累積多年的Western Blot代工經驗，使用 A1010 Protein-Free Blocking Buffer 皆能達到降低背景增加訊號的效果。目前 ACE Biolabs 執行 Western Blot 實驗皆已優先使用A1010 Protein-Free Blocking Buffer。