ELISA | 樣品的稀釋倍率該如何決定？
現今的ELISA Kit產品都非常的純熟，只要依照原廠提供的protocol進行實驗操作，再沒有人為疏失的情況下，大多都可以得到準確的結果。然而，最關鍵的問題其實是在於樣品濃度，由於ELISA Kit是利用抗原-抗體具有專一性的原理進行反應，因此，樣品中抗體的濃度或其他蛋白質成分過多時，可能會影響實驗數值。接下來，ACE Biolabs 依據實驗代工的經驗，提供幾點在樣品稀釋上需要注意的事項：
確認目標蛋白在樣品中的濃度
在知道目標蛋白後，可以參考相關文獻或其他相關資訊，得知目標蛋白會落在哪個濃度區間，同時，可以注意手中樣品的萃取方法、前處理、添加劑、狀態等，是否和文獻中的有所差異。接著，就是要選擇符合條件的靈敏度（Sensitivity）與檢測區間（Detection Range），例如：健康人類的血清中，IL-6（Interleukin 6）的含量通常＜7 pg/mL（E0025, Human IL-6(Interleukin 6) ELISA Kit, ACE Biolabs），此時就要選擇靈敏度＜7 pg/mL的ELISA Kit，若選擇了靈敏度＞7 pg/mL的ELISA Kit便無法得到準確的實驗結果。ACE Biolabs 提供高靈敏度、品質穩定、反應物種眾多（除了常見的Human、Mouse等，也有Porcine、Monkey、dog等）的ELISA Kit
如何知道樣品濃度？該將樣品稀釋嗎？
如果一開始就已知樣品中目標蛋白的濃度，還是建議先進行一次預實驗，可以先排除實驗進行中可能遇到的問題，避免浪費珍貴的樣品。
然而，大部分的樣品濃度都是未知的；在面對一個未知濃度的樣品時，前一步驟的文獻收集便更加重要，而預實驗也是一定要做的，這邊，我們有兩個建議的方向：1. 若樣品的量非常足夠，可以直接以原液進行預實驗。2. 若樣品的量非常珍貴，就需要以抗體稀釋液進行序列稀釋，序列稀釋的樣品通常是稀釋5-100倍，尤其是血清或血漿樣品，序列稀釋更是重要。血清或血漿中成分複雜，其中會含有讓抗體辨識目標蛋白的能力降低，稀釋後會降低其他物質對抗原-抗體結合的影響，反而會提高ELISA的數值。
以下就以ACEBiolabs的代工經驗，說明血清樣品稀釋的重要性：（E3742, Porcine cTnT/TNNT2(Troponin T Type 2, Cardiac) ELISA Kit, ACE Biolabs）。
由上面兩張圖就可以看出，1X稀釋與5X稀釋樣品所做出的實驗結果完全不同。在5X稀釋時，目標蛋白的數值反而是1X稀釋時的2倍以上，在這樣的情況下，5X稀釋後的實驗結果較具有可信度。血液中的成分太過複雜，有些非目標蛋白的物質也會搶奪抗體，反而使真正的目標蛋白無法與抗體結合，造成數值的不準確，所以，在進行血清或血漿樣品的檢測時，”稀釋”是非常重要的，然而，稀釋的最佳倍率會依據樣品的不同或目標蛋白的不同而有所差異。最後計算樣品濃度時，記得要將稀釋倍率乘回去喔！
樣品濃度是否符合標準曲線（standard curve）
想要知道待測樣品中的目標蛋白濃度，Standard curve絕對是最重要的一環。每個ELISA Kit中都會附上標準品，利用標準品的連續稀釋來製成標準曲線，製備標準曲線的濃度至少要有5個。標準曲線會包含無法檢測到最大訊號的濃度範圍，標準曲線完成後，就可以利用內插法算出待測樣品的濃度。
不過，可不是將標準品稀釋之後所得的數據都可以作為標準曲線喔！要判斷標準曲線有沒有可信度，還需要R2值，R2值表示的是讀值與標準曲線的對應關係，最完美的情況下是R2=1，但是，實驗難免會有誤差，所以只要R2>0.98，就是可以信賴的標準曲線。
現在大部分的ELISA Reader都有內建的standard curve生成功能，若沒有自動計算的程式，也可以用Excel或其他統計軟體進行作圖。以下，就以ACEBiolabs代工實驗實際的數據為例：（E3645, Porcine IL-1β(Interleukin 1 Beta) ELISA Kit, ACEBiolabs）。
此圖是利用M2 ELISA Reader內建程式所做的圖，一般標準曲線都像這樣，呈現S型的曲線。
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