Cell culture | 細胞培養
每個實驗室都會進行細胞培養，看起來細胞培養非常簡單，但是實際上卻有許多注意事項。以前研究所時，老師曾經告訴我們，要把細胞當作「男/女朋友」，要了解他/她的需求、要每天噓寒問暖和細心呵護。也許聽起來很誇張，但是對於新進實驗室的菜鳥們，細胞培養的確是一大難題。
了解細胞
開始進行實驗前，必須先了解細胞的種類和培養條件，才能夠先對目標細胞有基本的認識，以及準備細胞需要的環境。
開始實驗前，必須先要了解細胞的身分，包含來源 (人類或老鼠)、組織來源 (肝臟或肺臟)、細胞型態 (圓球、紡錘或完全貼平) 等等。尤其是細胞的型態，用來確認細胞培養時，細胞是否生長良好。
確認好細胞的身分和培養液後，接下來要選擇細胞住的房子——細胞培養皿。實驗室看到的細胞培養皿並不是簡單的無菌塑膠而已，貼附的過程為，細胞首先分泌細胞外基質，這些蛋白質黏附在培養皿的表面，然後細胞才透過細胞膜和細胞外基質的作用黏附到培養皿底部。因此，除了細胞本身的特性之外，也和培養皿表面結構有關。以前最早的細胞培養皿材質為玻璃，但是因為不容易清潔乾淨，以及細胞貼附效果不好，通常需要表面塗層處理，因此後來改用拋棄式的塑膠。使用的塑膠材質為 polystyrene，為有苯環的長碳鏈，優點在於其光學透明性、容易塑模以及可以使用輻射殺菌。缺點卻是它非常疏水，因此會經過尖端放電或是氣體電漿處理，產生的高能量氧原子作用在 polystyrene 上，產生大量的羥基和羰基，而增加親水性。後來更加上合成的 polymer poly-lysine，提高生物相容性，增加細胞貼附和生長。市面上的細胞培養皿沒有太大差別，都可以購買使用，只不過有不同大小的培養皿，依實驗需求購買，切記不要把10 cm dish 和 petri dish 、96 well plate 和 ELISA plate 搞混。有些實驗者會自己再黏附上 collagen Type I, fibronectin, vitronectin 等，增加細胞貼附能力。
更有趣的是，有些實驗反而會需要細胞不要貼附，就會需要購買 ultralow culture dish，這類的培養皿經過別的處理，使得表面更疏水，而使蛋白質更不容易吸附。另外，隨著組織工程的進展，開始出現立體的培養基，使研究者更能模擬出細胞在組織間的作用關係，加上 3D 列印技術的革新，許多實驗室自己就能做出目標結構的培養基。
每種細胞有自己適用的培養液，通常可由網路上 ATCC 查詢，或是參考網友介紹也可。現在大多使用「合成培養基」，合成培養基是用化學合成方式取代天然萃取，可以確認每一種營養的濃度，確保每次使用品質皆相同。基本上包含鹽類、胺基酸、維生素等營養物質，通常適用於大部分的細胞。實驗室最常使用的是 DMEM (Dulbecco’s modified Minimal Essential Medium) 和 RPMI-1640，DMEM 還有分成低糖 (1000 mg/L) 和高糖 (4500 mg/L)，還有 DMEM/F12 為 DMEM 和 F12 1:1 混合。不過有些天然成分不容易用化學成分取代，所以通常還是會加入天然培養基，才能維持細胞的健康，現在普遍使用胎牛血清 (FBS)，比例為5-20%，最常用的是10%。
培養液有分成液態和固態粉末，液態的好處在於買來時即完成殺菌，可以直接使用，但缺點是保存時間較短；固態粉末保存時間較長，比較節省空間，價格也比較便宜，但是必須要自行配置，並且完成滅菌。兩者都是於4oC 避光保存，應避免凍於-20oC，解凍時可能會有營養成分析出，影響培養效果。另外，由於培養液含營養物質，在高溫下會失去活性，因此不能使用高壓高溫滅菌，通常使用過濾的方式去除微生物。需要注意的是，用來盛裝的血清瓶本身需要經過仔細清潔，高壓高溫滅菌後烘乾，才能夠放心盛裝過濾後的培養液。
細胞培養液通常採用 NaHCO3-CO2 緩衝系統，因此固態粉末的培養基需要按照包裝上說明添加碳酸氫鈉，而細胞培養箱也會另外給予5% CO2，穩定培養液的酸鹼值。另一種常見的緩衝液為 HEPES，為一種非離子兩性緩衝液，通常添加濃度為10-25 mM。另外，有些培養液會添加酚紅作為酸鹼指示劑，提供實驗者判斷培養液的酸鹼值。當培養的細胞數過多，會導致細胞大量排放代謝廢物到培養液中，而代謝廢物通常呈酸性，因此培養液會變成黃色，實驗者看到黃色即知道要更換培養液，或是繼代細胞。不過有些細胞實驗不適合添加酸鹼指示劑，市面上也可購買無色的培養液。亦可參考各種培養基的種類與應用。
儘管科學家使用化學合成方式組合出了「合成培養基」，但是依然會額外添加「天然培養基」，現在實驗室普遍使用的天然培養基就是胎牛血清 (FBS)，血清中含有各種血漿蛋白、多肽類、生長因子、激素等營養成分，這些都不容易用化學合成取代。胎牛血清優點在於營養成分豐富，培養細胞效果良好，可適用幾乎所有細胞。但是缺點在於成分複雜，批次間差異非常大，有時還有可能有病毒汙染，近年來因為人道主義等原因價格更是不斷上漲。由於血清批次間差異大，所以建議先訂購不同批次一瓶，測試有無汙染以及細胞生長情形，確認其效率後再統一訂購大量的同樣批次。另外，ACE Biolabs 提供 Specsure® Bovine Growth Serum (BGS) 是以小牛血清為基底的專利配方，額外添加其他營養成分，價格較便宜，且品質較穩定。
血清需要存放於-80oC 長久保存，可暫放4oC。對於大體積包裝，建議可以分裝使用。一般購買的血清均以經過無菌處理，而肉眼可見的懸浮物為蛋白質沉澱，可用離心或0.45 um 過濾去除。若想要進行無菌過濾 (0.22 um 過濾膜)，則千萬不要直接過濾，蛋白質沉澱會阻擋住孔洞，造成堵塞，必須先去除蛋白質沉澱後再行過濾。血清解凍應該於4oC 搖晃一到兩天，一定要均勻規則地搖晃，使溫度變化統一，避免沉澱產生。切記不要直接拿去37oC 解凍，過大的局部溫差變化會導致大量沉澱產生，降低營養成分。通常實驗室會將血清 heat-inactivation，步驟為已經完全溶解的血清經過56oC處理30分鐘，目的在於去除補體活性。
近年來，細胞治療蓬勃發展，培養的細胞會需要打回人體，因此實驗者需要盡量排除異種來源的產物，而研發出了人類血小板裂解濃縮液 (human Platelet Lysate, hPL)。人類血小板裂解液可以提供無異種來源的培養環境 (xeno-free)，不會有異種蛋白質造成的免疫反應，其培養效果和胎牛血清相當。不過因為也是天然培養基，所以成分也是無法確定，而且可能會有人類的細菌病毒汙染問題，因此需要選擇值得信賴的供應商。需要注意的是，並不是所有細胞都同時適用不同種類的天然培養基，因此若實驗者有意願更換，需要嚴謹的測試，檢測細胞型態、生長速率，甚至是基因表現和 DNA 甲基化分析。
很多實驗室為了預防細菌汙染，常會添加抗生素，最常用的就是 penicillin 和 streptomycin，ACE Biolabs 即提供 Penicillin-Streptomycin Solution (100X) (ACE Biolabs, CC1009)。其實一般細胞培養不需要添加抗生素，某些實驗甚至會要求不要添加 (如慢病毒包裝)；不過有些特殊實驗需要添加，像是從新鮮的組織中分離特殊細胞，由於一開始來源無法確定無菌，所以必須添加多種抗生素。
細胞汙染最明顯的特徵就是上清液混濁、培養液變色、細胞大量死亡，有些甚至會出現油油的感覺，一旦發現細胞汙染，則切記將其拿到細胞房外處理，不要傾倒於細胞房內水槽，避免汙染擴散。使用的培養液和其他用品都要經過測試，找出汙染源並仔細清潔。最麻煩的汙染是黴漿菌 (或稱為支原體)，黴漿菌為無細胞壁的原核生物，細胞型態不固定，大小0.2-0.3 um，因此有一定機率通過0.22 um 過濾膜，造成細胞汙染。由於沒有細胞壁，因此可以對抗部分抗生素，需要使用特別的抗生素才行。感染的細胞不會死亡，沒有明顯的特徵，但是培養液可能容易變色，細胞生長緩慢，顯微鏡高倍觀察下，還可以看到奇怪的小黑點。一般檢測的方法使用聚合酶連鎖反應 (PCR)，偵測黴漿菌的特定 DNA 片段，以電泳確認，通常直接取培養幾天細胞的上清培養液即可。ACE Biolabs 提供 Mycoplasma Detector (ACE Biolabs, CM1001)，不需要跑電泳，僅通過肉眼觀察顏色變化即可，還附上 positive control 做顏色的比對。
有些細胞會有特殊需求，如 glutamate、growth factor 等等，實驗室舊有的細胞按照實驗室習慣培養，而新的細胞需要於網路上查詢，添加建議的營養。有些細胞於官網 (如 ATCC) 會建議過多或是過於昂貴的添加物，此時可查詢一般網頁，或是可先嘗試一般的培養條件，如果細胞生長情況皆正常 (型態和生長速度)，則可以改用其他條件。
無菌操作注意事項
確認好細胞種類和培養環境需求後，開始進入實驗室操作，首先要注意的就是「保持乾淨」，因為一不小心就有可能將數個月的心血全部白費。通常實驗室會有一間「細胞房」，擺放細胞專用的一些設備，包含離心機、自動吸量管 (autopipette)、微量吸管 (pipetman) 等，避免和細菌實驗共用設備而導致汙染。需要特別注意細胞操作檯、細胞培養箱和二氧化碳鋼瓶。
細胞操作會在「生物安全操作檯 (Biological Safety Cabinet, BSC) (class II)」進行，和一般的「化學抽氣櫃」或「無菌操作檯」不同。化學抽氣櫃是負壓，避免化學物質滲透到外面空氣中；而無菌操作檯則是正壓，由外界吸入空氣，經由高效率過濾網 (HEPA) 過濾後，將乾淨的空氣送出，避免外在空氣微生物進入。生物安全操作檯是內循環系統，由外界吸入並過濾的空氣，會在操作檯前後兩端被吸入，並不會流到外面，因此操作檯內外的空氣完全隔離。這樣的好處在於除了可避免外界微生物進入汙染，同時也可以避免內部感染性生物 (如病毒) 暴露到外界。而維持穩定的氣流需要控制拉門在特定高度，過高或高低皆會導致氣流不穩定，影響安全狀態。比較舊型的生物安全操作檯沒有自動化系統，必須由人力判斷高度，通常會在拉門下緣貼上一張紙條，正確的高度會讓紙條水平浮起。新型的操作檯會自動偵測，錯誤的高度會使系統發生警報聲，因此較容易判斷。
細胞培養箱有完整的偵測功能，能夠精準地控制溫度和二氧化碳濃度，新型的培養箱甚至可以設定濕度，以及可以內部滅菌 (記得要移走細胞和特定物品)。如果無法控制濕度，則通常會放置水盤以維持足夠的溼度，避免培養液蒸發造成鹽類劇烈變化，影響細胞生長。水盤應使用高壓滅菌過的二次水，並定期清洗更換。平常使用時，要注意二氧化碳濃度、溫度及水盤是否有污染。
細胞培養液通常儲存於4oC環境，保持培養液中營養成分，因此使用前必須回溫。通常細胞培養溫度為37oC，因此會使用水浴槽加熱培養液至相同溫度，才開始進行實驗。水浴槽使用一次水即可，並添加抗菌劑，延長使用使間。使用時要注意，不要讓水平面低於加熱棒，以免發生危險。切記要定期清洗，保持乾淨。
若細胞培養基以碳酸鹽為 pH 緩衝系統，則需補充二氧化碳以達到緩衝作用，通常設定在5%，遠高於自然環境中的濃度，因此需要另外提供二氧化碳。有些實驗因為特殊需求需要低氧環境 (<20%)，此時會使用氮氣取代空氣，降低氧氣濃度。兩種氣體使用的鋼瓶為了安全，必須固定於牆上，並且準備兩個，一個備用。
細胞實驗用品無菌處理
通常購買的細胞培養皿和使用的溶液皆已經經過無菌處理，其他自行配置的物品必須先經過無菌處理，才能夠處理細胞。無菌處理的方式有高壓蒸氣滅菌法 (濕式滅菌)、乾熱滅菌 (乾殺) 及過濾除菌。
使用高壓滅菌釜，在高壓飽和水蒸氣作用下，120oC 作用15-20分鐘。適用於耐高溫的容器及不會因高溫破壞成分的溶液。
使用烘箱，170-180oC作用1-4小時。適用於玻璃器皿 (如玻璃吸管)，滅菌完即可使用，不需要等待烘乾時間。
多數營養成分會因為高溫作用破壞活性，因此只能用過濾法滅菌。使用0.22 um 孔徑的過濾膜，使用針筒連接推入液體，出口處即為無菌狀態。作用原理在於0.22 um 孔徑小於病原體，因此可以去除微生物。需要注意，不同種類溶液要選擇不同過濾膜，實驗室常見的 polyethersulfone (PES) 可以過濾大部分的水溶液，但是千萬不能拿來過濾有機溶液。
一般細胞培養：
了解細胞生長條件，以及能夠正確地保持無菌操作後，接下來進入到細胞培養。細胞一般培養可分成三部分，解凍細胞、一般培養以及冷凍細胞，熟悉三個步驟的操作後，才能夠獨立操作細胞實驗。
細胞通常保存於液態氮裡，拿取細胞凍管時需要注意安全。拿取前必須加熱水浴槽至37oC，並溫熱好細胞用培養液。拿取細胞凍管後，應「迅速」放入水浴槽中，快速回溫。如果於常溫回溫，微觀來看，細胞凍管最外層會先溶化，此時內部依然處於低溫，所以又會使外層溶液凝固，造成細胞溶液反覆凍溶，造成不可回復的損傷。因此，需要以37oC 快速回溫，降低細胞損傷。
通常細胞冷凍液含有高濃度 DMSO，因此解凍細胞時至少要以培養液稀釋10倍，並且於隔天更換培養液。為了避免 DMSO 殘留，也可以離心去除 (300 g 3-5分鐘)，重新以培養液懸浮細胞。由於細胞剛於特殊環境中回復，因此必須等待一至兩周的時間 (中間需要繼代)，細胞生長和特性才會恢復正常，此時才能夠進行細胞實驗。
開始培養細胞，需要練習細胞一般的繼代、細胞計數和觀察細胞生長情形。
細胞培養至高密度時，必須收集細胞更換至新的培養皿，即一般稱作「繼代」。對於貼附型細胞而言，需要破壞細胞和培養皿之間的連結，通常使用 trypsin-EDTA 處理。胰蛋白酶 (trypsin) 可以破壞細胞和培養皿之間的蛋白質連接，而 EDTA 則可以螯合 Mg2+ 和 Ca2+，這些二價離子為細胞之間連結蛋白的輔因子，因此 trypsin-EDTA 可以「切」下細胞。去除掉舊的培養液後 (通常使用吸引器 suction)，由於培養液中的血清會抑制胰蛋白酶作用，因此會先以約培養液一半體積的 PBS 清洗細胞表面。去除 PBS 後再加入約1/10培養液體積的 trypsin-EDTA，於培養箱中反應數分鐘。Trypsin-EDTA 濃度常使用0.05%，視情況可以調整濃度，而時間常為1-10分鐘，視細胞種類而定。新接觸的目標細胞建議每1-2分鐘拿出來，於顯微鏡下觀察，成功切下而懸浮的細胞會成圓形，前幾次確認好時間後，以後都固定的時間即可。之後，加入適量的培養液中和 trypsin-EDTA，並取部分細胞液至新的已加入新鮮培養液的培養皿中，搖晃使細胞均勻分布，可採取上下左右搖晃或是8字搖晃，切忌避免使用圓圈式搖晃，容易使細胞聚集在中間。
細胞繼代的比例依據細胞種類有所不同，新的目標細胞建議嘗試多種比例。新的目標細胞建議進行細胞計數後，取一定的細胞數繼代。一般來說，多數細胞三天大概增加為10倍，因此繼代數目為滿盤細胞數的1/10。要注意的是，不同細胞的大小不同，造成滿盤細胞數有所差異，通常培養皿的廠商會提供滿盤細胞數，但是實際上要自己確認。像是纖維母細胞可能細胞較大，因此滿盤細胞數可能較少。大部分細胞對於 trypsin-EDTA 有一定的耐受性，但是若最後細胞液中 trypsin-EDTA 比例大於1/10，或是比較敏感的細胞，則需要先離心 (300 g 5分鐘) 去除上清液，再以培養液懸浮。懸浮型細胞則直接吸取細胞溶液，以離心 (300 g 5分鐘) 去掉上清液後，以新鮮的培養液重新懸浮，再取適量的細胞繼代即可。
剛接觸新的細胞，或是要進行細胞實驗時，會需要計算細胞濃度，可以使用傳統的血球計數器或是自動計數器。自動計數器雖然方便快速，但是無法分辨死亡細胞和黏在一起的細胞，因此會有些微誤差。血球計數器有兩個計算槽，每一個計算槽刻劃9個1 mm2 的正方形。當放入10 uL，蓋上蓋玻片時，液體的深度為0.1 mm，因此每一個正方形體積為 0.1 mm3，即為10-4 mL。因此，使用肉眼計算一個正方形的細胞數，除以10-4 mL (或乘以104/mL)，即可算出細胞濃度 (/mL)。實際上為了更加準確，通常會計算四個角落正方形的細胞數，取平均後再做計算。
另外，為了分辨活細胞，通常會加入 trypan blue (0.4 % Trypan Blue Solution (ACE Biolabs, CC1005))，此染劑只能通過死亡細胞的細胞膜，因此死細胞會和背景同顏色 (藍)，活細胞則是中間澄清無色。計算時，只計數活的細胞，最後記得要乘上稀釋倍率。舉例來說，取20 uL 細胞液加入20 uL trypan blue，混合均勻後放入10 uL，計算四格細胞數共100顆細胞，因此原本細胞液的濃度就是100÷4×104×2 =5x105/mL。要注意血球計數器和自動計數器都有限制細胞濃度，過濃的話要先以培養液或 PBS 稀釋，過稀的話則必須先離心細胞液，以較少體積的培養液懸浮以增加濃度。
細胞於培養皿中生長的速率並非相同，分成延遲期 (lag phase)、指數期 (log phase) 和穩定期 (stationary phase)。細胞剛種下時，會需要重新分細胞外基質、修復胰蛋白酶造成的損傷、重組細胞骨架、建立細胞之間連結等等，此階段生長較緩慢，稱為延遲期。不同細胞需要的時間不同，數小時到兩天都有，要仔細觀察目標細胞的變化，一般來說是以細胞全部貼附當作基準。接下來，細胞開始快速生長分裂，即進入指數期。此階段的細胞最有活性，因此大部分的藥物測試實驗會在此階段進行。最後，當培養液中的營養成分消耗殆盡，或是沒有細胞生長的空間 (培養皿)，細胞就會進入穩定期。大部分細胞停止分裂，時間一久，培養液中代謝物累積過多，會造成細胞死亡。不同細胞的階段時間皆不相同，可以使用 CCK-8 Cell Counting Kit (ACE Biolabs, CC1007) 測定細胞生長情形。
有些細胞的處理花費時間較長 (如製作穩定細胞株) 或是花費較貴，或是純粹是增加實驗室細胞庫存，都需要冷凍細胞保存。目標細胞應處於健康的狀態 (不健康的細胞冷凍後還是不健康)，並且處於生長活躍期 (8-9成滿)，千萬不要過滿導致細胞生長停頓 (如果不小心過滿，則先行繼代，下一次再冷凍)。冷凍細胞使用的保存液建議新鮮配置，通常使用培養用的培養液，添加5-10% DMSO，搭配30-50% FBS。細胞濃度建議1-5x106 cells/mL，一管1 mL。細胞冷凍用的管子被稱作「冷凍小管」，是內旋式蓋子，可以避免因為冷凍解凍造成的溫差而爆裂。實際操作和一般培養步驟相同，取適量細胞離心 (300 g 3-5分鐘) 去掉上清後，以保存液懸浮細胞，分裝到冷凍小管中，放入「漸凍盒」，並放入-80oC，隔天移到液態氮裡。注意細胞只能暫放-80oC，長期需要保存於液態氮中。
細胞冷凍的過程和解凍相反，需要足夠「緩慢」，「漸凍盒」的目的在於此。「漸凍盒」通常會添加「異丙醇」，因為剛好異丙醇降溫速率約為每分鐘1度。而在這個過程中，細胞外的水會先開始凝固，此時 DMSO 可以破壞水的結晶，使水結晶不會過大而破壞細胞膜。同時，細胞內的水分會滲透到膜外，細胞失去水分而成扁平狀，所有代謝反應也將停止，進入休眠狀態。要注意的是，異丙醇每使用約五次就要更換，因為即使是在低溫，冰箱中的水分也會進入異丙醇中，改變其濃度，造成降溫速率太快，差不多五次會到達極限，因此需要更換。
最後，細胞實驗需要注意很多事情，所以除非時間緊迫，否則建議安排足夠的時間，讓實驗者能有充分的時間處理細胞，千萬不要因為趕時間，導致汙染造成前功盡棄。同時，細胞實驗也需要專心一致，實驗者需要注意自己的精神和身體狀態，保持良好心情進入細胞房。
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