Western-blotting | 流程整理
細胞生物性實驗中，常常會需要檢測目標蛋白質的變化，可能是給予細胞某些刺激，或是調控細胞內基因的變化，而最簡單的方法就是西方墨點法 (Western-blotting)。此方法步驟大致包含：
［ACE Biolabs 抗體優化服務］
每支抗體，每種樣品都有最適合的 Western Blotting 的條件，需憑藉著深厚的經驗累積，從WB結果回推過程，一步一步調整，才能呈現完美的 Western Blotting 結果。您可以參考本文流程整理搭配西方點墨法常見問題 ( Western Blot )，快速累積經驗，或是交由ACE Biolabs 幫您找出最適合的 Western Blotting 的條件。
蛋白質收集
蛋白質樣本來源有很多種，包含動植物組織、血液和細胞，動植物組織因為含有很多細胞外間質 (extracellular matrix, ECM)，所以必須先使用液態氮研缽或是使用磁珠法磨碎組織，再加入裂解液破壞細胞。而細胞可以直接使用裂解液收集蛋白質。一般裂解液是透過兩性清潔劑 (detergent) 破壞細胞膜，而得到細胞內的蛋白質。組織使用的裂解液通常具有比較多種的兩性清潔劑，而且濃度通常較高。裂解液配方很容易在網路上查到配方，也可以使用 ACE Biolabs 1X RIPA Lysis Buffer (C1020)。
磨碎的組織或是細胞先以冰過的 PBS 清洗過一次 (可以使用 ACE Biolabs 10XPBS (C1015) 或是 20X PBS Buffer (C1037) 稀釋)。再加入適量的裂解液，均勻混合。通常會一同加入蛋白酶抑制劑 (ex: 100X Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free) (ACE Biolabs, A1029)) 抑制蛋白酶作用，如果之後要分析蛋白質的磷酸化，則需要加入磷酸酶抑制劑 (ex: 100X Phosphatase Inhibitor Cocktail (A+B) (ACE Biolabs, A1029))。混合好的裂解細胞液可以直接繼續下一步處理，或是在4oC 下搖晃1-2小時，可以增加細胞裂解的效果，再透過離心去掉細胞殘餘 (12,000 g 10 mins)，存放於-20 oC 或-80 oC。
如果此蛋白質樣本的目的是為了接下去的電泳，則強烈建議立刻接下去蛋白質處理來避免降解，只保留一小部分 (50 uL 以內即可) 測定蛋白質濃度。蛋白質濃度可以使用 A1034 Bradford protein assay (5X) 或是 A1035 BCA Protein Assay Kit。需注意的是，裂解液中的兩性清潔劑和鹽類都會嚴重地干擾測定結果，所以蛋白質樣本必須先進行稀釋後才能測定 (至少稀釋十倍)。
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蛋白質前處理
開始電泳前，蛋白質必須先以 protein sample dye 處理。其目的有四，一是變性蛋白質，因為唯有變性後蛋白質的大小才和分子量呈正比，一般蛋白質在溶液中呈現球形，而 SDS 可以和蛋白質的疏水性區域作用，再因為負電端相互排斥將蛋白質拉呈線型。二是 B-ME 或 DTT 可以打斷蛋白質的雙硫鍵，使某些多聚體的蛋白質變回單體，也可以防止蛋白質本身氧化。前兩者同時還可以永久地抑制蛋白酶，所以建議盡量盡快處理。三是甘油 (glycerol) 可以增加溶液的密度，使得蛋白質樣本上樣時沉降到樣本槽的底部。最後是溴酚藍 (bromophenol blue) 染色，使得電泳時能有一個簡單的依據判斷進度。依據個人習慣可以選擇 B-ME 或 DTT，以及不同倍數的原液，ACE Biolabs 提供 5X Protein Sample Dye (ß-Me) (A1020), 5X Protein Sample Dye (DTT) (A1021), 6X Protein Sample Dye (ß-Me) (A1022), 6X Protein Sample Dye (DTT) (A1023)。以100 oC 處理10分鐘，置於室溫冷卻後，儲存於-20 oC。建議可以再次離心 (12,000 g 10分鐘) 去掉雜質，因為電泳時蛋白樣本中的雜質容易造成條帶不平整。
SDS-PAGE (含膠體配置、蛋白質樣本上樣、電泳)
開始電泳前需要先配置膠體，通常分成上膠和下膠，上膠稱為聚集膠體 (stacking gel)，功能在於使具有一定體積的蛋白質樣本溶液壓縮到極小的體積。原理是因為電泳緩衝液中的 glycine 在上膠 pH 6.8 下不帶電，形成一電中性空洞區，使得蛋白質泳動非常緩慢，全部蛋白質樣本被濃縮到一條線，一直到進入下層膠體 pH 8.8，glycine 才會帶負電，蛋白質才會開始快速移動。而下膠稱為分離膠體 (separating gel)，開始快速移動的蛋白質會因為不同大小而逐漸分離開來，由 acrylamide 形成的孔洞限制，小蛋白質移動地較快，大蛋白質則較慢。因此 acrylamide 濃度由目標蛋白質大小所決定，一般使用10%，如果目標蛋白質在50KDa 以下或是150KDa 以上才需要改變濃度，大分子量蛋白使用低濃度，而小分子量蛋白使用高濃度。
膠體中需要的成分可由 ACE Biolabs 中購買，包含 30% Acrylamide Solution (29:1) (C1005)、10% SDS solution (A1024)、ammonium persulfate (APS) (C3009)、TEMED solution (C1012)。Acrylamide 形成膠體的基本骨幹，由 Bis 形成架橋，TEMED 當作催化劑，APS 提供自由基引發連鎖反應。配置過程中要確保所有溶液均勻混合，配方可以參考 (C1005)，最後才加入 APS，並且要立刻製作膠體。下膠大約到整體的2/3，以甲醇或異丙醇壓平表面並且去除氣泡，等待約40-50分鐘凝固。去除甲醇或異丙醇後才倒入上膠溶液，快速插入齒梳後，等待約10-20分鐘凝固。
小心拔掉齒梳後 (切記不要破壞樣本槽)，架設好電泳裝置，倒入適量的電泳緩衝液。加入處理後的蛋白質樣本，通常會加入相同量的蛋白質，記得要保留空格放入 protein marker。電泳步驟依據個人習慣使用，通常會用較低電壓進行聚集 (60-90 V 20-40分鐘)，再用較高電壓分離不同大小蛋白質 (100-140 V 60-120分鐘)。電泳緩衝液的配方可在網路上查到，而 ACE Biolabs 提供特別的電泳緩衝液 10X FASTRunning Buffer (A1007)，可以直接使用 170 V 60-70分鐘即可完成電泳全部過程，相比於一般的電泳緩衝液而言，可以在節省時間的情況下，保留完好的解析度以及避免溫度劇烈升高。
除了繼續進行轉印和使用抗體偵測目標蛋白質之外，有些實驗會需要檢測整體蛋白質的分布情形，比如蛋白質純化。這時就必須對膠體的所有蛋白質進行染色，傳統上使用 coomassie Brilliant R-250 (CBR) 染色 (染成藍色)，半小時之內完成，但是最大缺點在於背景值非常高，需要以清水退染一整天，或是以具有腐蝕性和酸性的脫色液 (含甲醇和乙酸) 處理。而 ACE Biolabs 提供的 QuickBlue Protein Gel Staining (C6003) 可在相同時間內完成染色，而且背景值極低，只要使用清水即可在半小時之內完成退染。
轉印 (transfer)
以電泳分離不同大小的蛋白質後，需要以專一性的抗體偵測，但是因為膠體本身脆弱不易操作，所以通常會將蛋白質轉印到膜上，最常見的是 PVDF (polyvinylidene-Fluoride) 和 NC (nitrocellulose)。NC 膜透過疏水性作用力吸附蛋白質，吸附力較強，價格比較便宜，但是本身質地比較脆弱，容易在反覆的清洗和反應中破損。而 PVDF 膜質地比較堅韌，可以反覆使用，但是價格比較昂貴，須注意的是其需要先以甲醇活化表面正電基團，才能夠有效地吸附蛋白質。
而轉印原理是透過電壓使得蛋白質移動到轉印膜上，在裝置時須注意蛋白質是從負極往正極移動，所以轉印膜必須靠近正極。過程有分成濕式 (wet) 和半乾式 (semi-dry)，濕式轉印顧名思義就是需要比較多的緩衝溶液 (1L 以上)，裝置好的卡夾 (包含濾紙、膠體和轉印膜) 整個浸泡在裝有電極的緩衝液裡。優點是因為緩衝溶液較多，所以比較不容易發熱，甚至可以整個拿到冷房裡進行，本身結果較為穩定，也比較適合大分子蛋白 (超過180 KDa)。缺點在於使用較多的溶液，而且耗費時間長 (兩小時以上)。而半乾式轉印的最大好處就是節省時間，通常半小時之內可以完成，原理是透過大尺寸電極板給予強大的電場，在兩電極之間放上膠體和轉印膜，所以也比較節省緩衝溶液 (100-200 mL，浸泡濾紙即可)。缺點在於不適合大分子量蛋白質，時間拉長會導致少量的緩衝溶液溫度遽烈升高，容易出現濾紙和膠塊被烤乾的情況。電壓電流都需要參考機器本身的使用方式，而緩衝溶液可以選用 C7039 ACEolute™ Rapid Transfer Buffer Instant Granules。適用濕式轉膜系統，約30分鐘即可完成轉膜。
封閉 (blocking)
轉印膜和抗體反應之前，必須先進行封閉。轉印膜上除了蛋白質之外還有很多的空白區域，抗體本身也是蛋白質，很容易就吸附到上面，造成背景值增加，所以必須先封閉這些空白區域。實驗室傳統上也是最常見的方法就是3-5% non-fat milk (配在 TBST 或 PBST 裡)，透過牛奶中的蛋白質封閉空白部分，通常反應時間為室溫一小時。雖然價格便宜方便，不過缺點在於通常接下去的抗體時間需要過夜反應，而且牛奶裡面本身蛋白質雜質較多，容易吸附在轉印到膜上的蛋白質上，使得訊號降低，有時也會因為牛奶中的蛋白質剛好能被目標抗體辨認，造成背景值增加。A1010 Protein-Free Blocking Buffer 使用了奈米粒子封閉，可以有效地增加訊號，並且不容易和抗體反應。ACE Biolabs 提供的 Western Blot Signal Enhancer – Nanograde (A1001) 則進一步優化過程，可以直接將轉印膜浸泡在含有抗體的溶液裡，抗體反應的同時進行封閉，只需要1-2小時，可以使得 Western-blotting 在一天之內完成。須特別注意，封閉的時候需要緩慢地搖晃，使得整張轉印膜反應均勻。
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一級抗體反應 (primary antibody incubation)
封閉完的轉印膜開始和抗體反應。Western-blotting 的精髓在於透過抗體和目標蛋白質的結合，可以專一性地偵測目標蛋白質的含量。抗體依據使用時機可以分成一級和二級抗體，前者直接偵測目標蛋白質，後者則是偵測一級抗體，通常是辨認一抗的物種性 (如老鼠或兔子)。這樣進行的好處有二，一是可以有效地放大訊號，因為一個一級抗體可以同時被多個二級抗體辨認。二是由於抗體上必須帶有螢光或酵素，本身發出訊號，或是反應基質產生訊號，才能夠被偵測到。而在抗體上接上東西的步驟必須由試管內化學反應完成，無法由生物本身完成。所以如果只有一級抗體，則每支抗體都必須另外鍵結反應，而一支二級抗體可以針對所有同樣宿主產生的一級抗體，因此二級抗體可以大幅度地降低成本。
一級抗體有分成單株和多株，多株抗體可以同時偵測多的抗原，可以得到較強的訊號，不過也會有比較多的非專一性訊號，而單株本身專一性較高，但是訊號較弱。一級抗體通常配在封閉溶液裡，使用濃度介於1/500-1/5000，通常一支新的抗體必須要試驗最佳的濃度，有些甚至可以重複使用。而抗體的反應時間可在室溫1-2小時，或是4度過夜，根據經驗通常後者可以大幅度地降低反應抗體濃度。須特別注意反應時要緩慢地搖晃，使得整張轉印膜反應均勻。
一級抗體的選擇往往是影響Western-Blotting 成敗的最大關鍵。除了從產品資訊內容選擇符合實驗用途的抗體物種來源之外，實驗材料不同一抗孵育的條件仍需測試。ACE Biolabs 提供抗體測試實驗，由您提供樣品，ACE Biolabs 為您抓出最適合您的實驗條件。
更多抗體相關資訊: Western-blotting | 如何選擇抗體?
二級抗體反應 (secondary antibody incubation)
一級抗體反應完成後，需要先以洗滌液清洗三次，可以使用 TBST 或是 PBST，一次5-10分鐘。接下來才加入二級抗體，通常使用 TBST 或 PBST 配置，濃度1/10000-1/20000，室溫反應一小時。二級抗體上最常見的酵素為 HRP (horseradish peroxidase)，為過氧化氫酶，具有高穩定性的優點。可參考 ACE Biolabs 的 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP (A1013S) 和 Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP (A32211PI)，網站上也可找到針對其他宿主的二級抗體。
上機紀錄結果
加入基質以前也一樣需要洗滌三次，通常也會使用 TBST/PBST，不過有些經驗指出這兩種洗滌液中的鹽類和 Tween 會干擾基質反應，所以也可以使用 ddH2O 洗滌。基質依據反應結果可分成兩種，放出冷光或是直接呈色。3,3'-diaminobenzidine (DAB) 可以在反應完後直接呈現棕色，肉眼可見，且能長久保存，但是只能得到一張照片結果，而且要精確地捉準結束反應的時機。而冷光可由底片曝光或是由機器接收訊號，機器的好處在於可以即時地偵測，得到多張照片結果，再選擇適合的時間，避免固定的時間內某些訊號過弱或過強，可以參考使用 A1041 ACEsignal Chemiluminescent Substrate - Pico。
轉印膜抗體剝離再生 (stripping)
如果蛋白質樣本非常珍貴，或者是不想再次進行電泳節省時間，則可以去除轉印膜上的一級和二級抗體，重新使用。Stripping buffer 原理是透過強酸和高鹽破壞抗體和抗原之間的交互作用，甚至是加熱增加效果，而 ACE Biolabs 提供A1039 NuBlot™ Stripping Buffer ，不需要加熱即可有效地去除抗體。需要特別注意的是，Stripping 時間控制在5-10分鐘以內，過長時間會導致轉印膜上的蛋白質脫落過多，造成之後偵測訊號低弱，而且需要重新封閉才能繼續和抗體反應。另外，Stripping 會導致些微蛋白質脫落，所以不能和沒有 stripping 的轉印膜一起比較。
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