Western blotting | 背景過高問題
在進行Western blotting時常有背景過高的問題，那為什麼會出現背景過高的狀況呢？背景與呈色有關，因此，影響呈色的的因素即會影響背景。
以下介紹影響呈色原因：
［Blocking］
由於轉印膜上除了樣品蛋白質，還有許多空白區域，因此需先封閉這些空白區域，防止抗體非特異性地結合到轉印膜上，造成背景增加。因此，可以藉由調整Blocking buffer的配方與使用時間，減少背景過高的問題。
(1) 選用不同的blocking buffer:
常用的blocking buffer有牛奶、Bovine serum albumin (BSA) (ACE Biolabs, C3001)、Protein-Free blocking buffer (ACE Biolabs, A1010)，然而牛奶中成分較複雜且含磷酸化蛋白質，可能造成訊號干擾及背景較高，因此您可以嘗試不同的blocking buffer。
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(2) blocking不完全:
可以嘗試延長時間，也可以於4度blocking過夜。使用BSA的情況下也可以增加濃度至5-10%。
［一級抗體］
透過抗體和目標蛋白質的結合，專一性地偵測目標蛋白質含量。當抗體稀釋濃度太高可能導致雜訊產生、背景值過高也浪費昂貴的抗體；稀釋濃度太低又可能導致訊號無法被偵測或不明顯。因此，可以藉由調整一級抗體濃度及時間減少背景問題。
(1) 調整一級抗體濃度:
拿到抗體時，先進行抗體濃度梯度測試實驗，選用適當濃度進行實驗
(2) 增加一級抗體培養時間:
將一級抗體使用Blocking buffer稀釋，於4度培養過夜，增加專一性。
［洗滌步驟］
洗滌不充分會造成抗體在轉印膜上非特異結合，導致高背景問題發生。
因此可以藉由增加洗滌次數和用量，或在洗滌液中添加Tween-20、SDS或NP-40等表面活性劑，去除未結合的抗體、減少非特異性結合。ACE Biolabs提供10X TBST (ACE Biolabs, C1025)，Tween 20終濃度為0.05%。
［ECL呈色］
當目標蛋白質訊號較強時，只需要短時間曝光即可偵測到訊號；然而當目標蛋白量較少時，則需藉由增加曝光時間與ECL靈敏度得到實驗結果，增加曝光時間的同時，也需考量ECL的持久度。ACE Biolabs提供三款ECL冷光試劑，ACEsignal Chemiluminescent Substrate–EcoPlus (ACE Biolabs, A1040) ACEsignal Chemiluminescent Substrate–Pico (ACE Biolabs, A1041) ACEsignal Chemiluminescent Substrate–Femto (ACE Biolabs, A1042)，您可以根據預算與實驗設計，選用最適合的ECL已得到最佳實驗結果。
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