Plasmid extraction | 原理介紹
質體為分子生物學實驗中不可或缺的載體，質體為細胞內環狀DNA片段，在宿主細胞核外仍然能進行DNA複製，包含複製起始點 (Origin of replication)、細菌抗生素 (Antibiotic resistance gene)、細胞抗生素 (Selectable marker)、多克隆位點 (Multiple cloning site)、Insert、啟動子 (Promoter) 及引子結合位點 (Primer binding site)。
質體製備包含三個步驟：(1)細菌培養放大 (2)菌體收集與裂解 (3)質體純化。而目前最常使用的Plasmid extraction方法為鹼性溶解法(Alkaline lysis)。以下介紹使用試劑與功用：
(1) Solution 1：將菌體懸浮於溶液中
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成分 |
功用 |
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25 mM Tris-HCl（pH8.0） |
緩衝溶液，維持pH值穩定 |
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10 mM EDTA |
與微生物金屬離子結合，抑制DNase活性 |
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50 mM Glucose |
增加溶液黏稠度，避免菌體沉降，保持懸浮 |
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RNase |
降解溶液內RNA |
(2) Solution 2：將細胞裂解
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成分 |
功用 |
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250 mM NaOH |
細胞膜成分為磷脂類物質，利用強鹼使酯鍵斷裂，破壞細胞膜 |
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1％（W/V）SDS |
與Solution 3反應 |
*需要注意加入solution 2後不可劇烈晃動且時間不能過長，這會使DNA斷裂。
(3) Solution 3： 中和solution 2 強鹼，清除細胞內雜質
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成分 |
功用 |
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3M potassium acetate |
與solution 2 中SDS反應，與變性蛋白質生成不溶於水之potassium dodecylsulfate (PDS)，進而去除雜質 |
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5M acetic acid |
中和強鹼 |
(4) Washing buffer：
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成分 |
功用 |
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10 mM Tris-HCl （pH 7.5） |
清洗多餘鹽類 |
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80 % Ethanol |
*Washing buffer中含有高濃度乙醇，乙醇會影響DNA品質，並抑制後續的酶作用反應，在elution前需將乙醇完全去除。
(5) Elution buffer：
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成分 |
功用 |
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10 mM Tris-HCl （pH 7.5） |
將管柱內吸附膜上DNA沖堤至乾淨離心管中 |
*將elution buffer預先加熱65-70度可以提高產量。
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