Recombinant Protein | 重組蛋白原核表達系統 2019/12/04

Recombinant Protein | 重組蛋白原核表達系統

原核表達系統主要用途：基因功能研究、重組蛋白特性研究、重組蛋白製備。原核表達系統優點：大腸桿菌遺傳背景清楚、生長繁殖快、轉化效率高、經濟實惠、能快速大量生產蛋白。但目前原核表達系統還存在許多難以克服的缺點：例如通常使用的表達系統無法對時間及表現水平進行調控，某些基因的持續表達可能會有毒性對宿主細胞造成損害，過量表達也可能導致非生理反應，目的蛋白常以包含體型態表達，而導致產物純化困難；且原核表達系統翻譯後加工修飾體系較不完善，對於表達產物的生物活性較低。

在各種表達系統中，最早被採用研究的是原核表達系統，原核表達系統是將外源cDNA片段克隆到原核表達載體上然後轉化表達菌株，在原核生物來表達外源蛋白的系統，主要包括大腸桿菌表達、枯草芽孢桿菌表達、鏈黴素表達等。原核表達載體是能攜帶插入外源基因序列進入原核細胞中進行表達的載體。目前應用最為廣泛的原核表達載體是大腸桿菌表達載體，一般說的原核表達系統主要是指大腸桿菌表達。大腸桿菌表達載體主要有 pET系列、pGEX系列和 pQE系列。應用最多的是 pET系列，因為其能在大腸桿菌中高效且高產的表達蛋白。

一、大腸桿菌蛋白表達原理

1. 表達載體
   
   小型環狀 DNA或稱質體 DNA (plasmid DNA) 可以於大腸桿菌表達系統中自我複製。完整的載體必須具有複製起點 (origin of replication)、篩選標記 (antibiotic resistance)、 啟動子(promoter)、插入的目的基因 (coding sequence) 和終止子 (terminator) 。根據表達蛋白質的類型可分為單純表達載體和融合表達載體，前者是在目標蛋白的 N端/ C端添加特殊的序列，從而促進蛋白的可溶性和正確折疊，方便目的蛋白的快速親和純化，或者目標蛋白的表達定位。His-Tag 和 GST-Tag 是最常使用的融合標籤。
    
2. 表達宿主菌
   
   表達蛋白質的生物即為大腸桿菌。宿主細菌的選擇主要基於宿主細菌的特徵和靶蛋白的特徵。例如，靶蛋白需要形成二硫鍵。可以選擇Origami 2系列，Origami 可以顯著增加在細胞質中形成二硫鍵的可能性，並提高蛋白質的溶解度和活性。

二、菌株分類:

重組質粒的構建一般選擇遺傳穩定，轉化效率高，質粒產量高的菌株作為受體菌。作為表達宿主菌必須具備幾個基本特點：遺傳穩定，生長速度快，表達蛋白穩定。具體操作過程中，根據所使用的表達載體的特點，目的基因密碼子的組成等選擇特定的表達宿主菌。以下是實驗室常用的幾種表達宿主：

1. BL2：lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主對外源蛋白的降解。是經典的使用最廣泛的表達受體。適用於Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作為啟動子的載體。
    
2. BL21（DE3）： DE3 噬菌體溶於 BL21 形成的帶有染色體 T7 RNA聚合酶基因大腸桿菌。IPTG 誘導的 lacΜV5啟動子控制 T7 RNA聚合酶基因表達 T7 RNA聚合酶，進而控制 T7 表達系統表達目的蛋白。
    
3. BL21（DE3）衍生系列：在經典的T7表達系統BL21（DE3）的基礎上，Novagen公司開發了一些特殊的表達宿主細胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株帶有 trxB 和 gor雙突變。擁有 trxB 和 gor 突變的菌株比單具，trxB 突變的菌株更有可能促進二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。
    
4. Rosetta系列：是經過修飾，專用於帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達的菌株。經提高稀有 tRNA 水平，可以提高一些真核基因表達效率。
    
5. BL21-Codon Plus系列：這些受體菌添加了大腸桿菌中編碼精氨酸（R），亮氨酸（L），異亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密碼子的tRNA基因，更多用於表達一些真核生物的基因。其中 RIL 系列常用於 AT含量高的基因，而 RP系列主要用於GC含量高的基因。

三、表達系統分類:

1. T7 大腸桿菌表達系統 : 
   
   以T7 啟動子、T7 RNA聚合酶等 T7是菌體轉錄體系的元件為核心建構的表達系統，T7 RNA聚合酶是一種高活性的聚合酶，mRNA合成的速度比大腸桿菌內的聚合酶快5倍，某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶轉錄的序列也可以被轉錄，所以 T7 RNA聚合酶和T7噬菌體啟動子的存在情況下，大腸桿菌本身的轉錄比不上T7噬菌體轉錄體系，最終受到T7噬菌體啟動子控制基因的轉錄。需搭配染色體帶有 T7 RNA 聚合酶基因大腸桿菌，例如: BL21（DE3）或是其衍生系列大腸桿菌菌株作為表達宿主。
   
   pET載體系統是廣泛使用於在 T7大腸桿菌表達系統中表達重組蛋白功能的系統，載體上的噬菌體 T7 強啟動子能夠改變目的基因的轉錄和翻譯。細胞內存在 T7 RNA聚合酶時，重組蛋白的表達被刺激活化。當其處於完全誘導狀態時，幾乎所有細胞都會致力於表達目的蛋白，只需要幾個小時的誘導，目的蛋白的表達量就可以佔細胞總蛋白的一半。
    
2. Lac和 Tac 大腸桿菌表達系統 : 
   
   以大腸桿菌 LAC 操控子調控為基礎所建構的大腸桿菌表達系統，其具有多順反子結構: 啟動子 (lacP)-操控基因 (lacO)-結構基因 (lacZ-lacY-lacA) 在無誘導的情況下，負調節因子lacl基因產物形成四聚體阻擋蛋白與啟動子下游的操控基因緊密結合，阻止轉錄的啟動，加入誘導劑後 IPTG 與 lacI 基因產物結合，使操控基因解離出來 lac操控子的轉錄因此被激活，用 TAC 啟動子建構表達系統稱之為 tac 表達系統。
   
   pEGX系列載體多被應用於此系統表達的載體，其具有 IPt 表達的 Ptac（trp / lac）混合啟動子。當給予 IPTG 時，lac 產物與 Ptac 啟動子解離，並允許從啟動子下游序列轉錄。
    
3. PL 和 PR大腸桿菌表達系統 : 
   
   以啟動子 PL 和 PR 為核心建構的表達系統。PL 和 PR 表達系統具有很強的啟動轉錄能力，誘導時不需要加入化學誘導劑、成本低廉，但熱刺激的過程中，大腸桿菌中的一些蛋白水解酶會同時被激， 降解所表達的外源蛋白，其次是在大規模發酵培養菌體時，透過熱平衡交換方式提高溫度，需要較長的時間，這會降低誘導效果，而對重組蛋白的表達有所影響。
   
   PL 和 PR 啟動子是大腸桿菌 λ 噬菌中控制早期轉錄的啟動子， PL 和 PR表達載體系統是以該啟動子建構的高效表達載體。在 λ噬菌體中，PL 和 PR啟動子的轉錄與否決定λ噬菌體進入裂解循環或溶原循環。λ 噬菌體 PE 啟動子控制的 CI 基因表達產物是 PL 和 PR啟動子轉錄的阻遏物，而 CI 阻遏物的表達和在細胞中的濃度，取決於宿主與噬菌體因子之間的複雜平衡關係。
   
   由於通過細胞因子調節 CI 在細胞中含量的途徑很難操作，因而在構建表達系統時，選用溫度敏感突變體 CIts857 的基因產物來調控 PL 和 PR 啟動子的轉錄，在較低溫度(30℃)下阻遏物以活性形式存在，在較高溫度(42℃)下阻遏作用失活。因此，改變工程菌的培養溫度即可控制目的基因的表達，這比用誘導劑誘導表達的系統要節省操作步驟和成本，在大規模基因表達中優點尤其明顯。
   
   pBV220 載體是 λPL/PR-cI857 溫度敏感系統表達載體，能夠在42℃ 表達非融合的目的蛋白。另外，此載體的 SD sequence（用於結合原核生物核醣體的序列）後緊跟多克隆酶切位點，便於插入帶起始 ATG的外源基因，可表達非融合蛋白。載體含有強的轉錄終止子可防止出現"通讀"現象，有利於載體-宿主系統的穩定。

不同表達系統之優缺點.

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