Western-blotting | 蛋白萃取方法及注意事項 2019/11/20

Western-blotting

蛋白萃取方法及注意事項

在實驗過程中，我們常常需要藉由萃取細胞組織中的蛋白質，來觀察蛋白質表現量的變化。樣品蛋白質萃取品質的好壞非常重要，對實驗結果影響甚大，因此以下介紹蛋白質萃取方法及注意事項：

蛋白質樣品製備原則

實驗前要先充分了解實驗目的，根據實驗、分析的蛋白質，再決定如何進行樣本前處理，找出最適合的實驗方法。原則盡可能去除非蛋白質的物質，保留蛋白質，

1. 保留蛋白質: 維持低溫處理、添加蛋白酶抑制劑可減少蛋白質降解。
2. 去除核酸、多糖和脂類等可能產生干擾的大分子物質。
3. 依實驗目的選擇蛋白質裂解液

蛋白質裂解液(Lysis Buffer)常見成份

蛋白質裂解液(Lysis Buffer) 的基本組成為: pH緩衝液 (pH Buffer)、離液劑(chaotropes)、表面活性劑(sufactants/detergents)、鹽類、還原劑(reducing agent)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitor) 以及磷酸酶抑制劑(phosphatase inhibitor)。常見的蛋白質裂解液配方：ACE Biolabs 1X RIPA Lysis Buffer (C1020) 25 mM Tris-HCl pH7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS，絕大多數細胞或動物組織樣品皆可以此配方為基底，依照實驗目的添加離液劑、介面活性劑、還原劑、蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑，或調整其濃度。

1. 離液劑(chaotropes)：也稱為變性劑，可以破壞氫鍵等次級鍵，增加蛋白質的溶解性。代表試劑為尿素(Urea)及硫脲(thiourea)。常用含 5～8 M 尿素和 2 mol／L硫脲的緩衝液。
    
2. 界面活性劑 (sufactants/detergents)：破壞蛋白質間疏水作用，增強蛋白質在其等電點值處的溶解性。常用的是 非離子型界面活性劑 non-ionic detergents: 如:丙基磺酸鹽(CHAPS)、NP-40、Tween-20。離子型界面活性劑如 SDS，不適合在等電聚焦電泳(IEF)時使用。
    
3. 還原劑 (reducing agent)：斷裂蛋白質分子間的二硫鍵，使蛋白質處於還原狀態，以利肽鏈分離。二硫蘇糖醇(DDT)在鹼性條件下常帶有電荷，在IEF過程中可能遷移出 pH梯度，使某些蛋白質的溶解度降低而聚集沉澱。三丁基磷(TBP)是非離子型還原劑，IEF過程中不會在IPG上遷移，可大大增加蛋白質的溶解度及向第二相轉移的能力。
    
4. 蛋白酶抑制劑：
   
   因每種蛋白酶抑制劑僅作用於一類蛋白酶，所以建議聯合使用，或使用預混型的蛋白酶抑制劑: 100X Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free) (ACE Biolabs, A1029)。
   
   ① 苯甲基磺醯氟(PMSF)，抑制絲氨酸蛋白酶和部分半胱氨酸蛋白酶。4―(2―氨乙基，苯磺醯氟作用相似於PMSF，但溶解度更好。
   
   ② 乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙四乙酸(EGTA)，抑制金屬蛋白酶。
   
   ③ 肽蛋白酶抑制劑。如亮抑酶肽(1eupeptin)抑制絲氨酸蛋白酶和部分半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制劑A(pepstainA)抑制天冬氨酸蛋白酶。
   
   ④ 苯甲醯胺抑制絲氨酸蛋白酶。
    
5. 磷酸酶抑制劑：
   
   若WB的目標蛋白為磷酸化蛋白，先確認其蛋白被磷酸化的氨基酸為絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸，挑選磷酸酶抑制劑，若未知磷酸化的氨基酸，則一般選用1 mM NaF & 2 mM Na₃VO₄使用預混型的磷酸酶抑制劑: 100X Phosphatase Inhibitor Cocktail (A+B) (ACE Biolabs, A1029)。
   
   ①氟化鈉(NaF, sodium fluoride), 為絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶抑制劑(serine/threonine phosphatase inhibitor)常用濃度為 1 mM NaF。
   
   ②钒酸钠(Na₃VO₄, Sodium orthovanadate, ), 酪氨酸磷酸酶抑制劑 (tyrosine phosphatase inhibitor) 常用濃度為 2 mM Na₃VO₄。
   
   ③ 焦磷酸钠(Na₂P₂O₄, sodium pyrophosphate) 為絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶抑制劑(serine/threonine phosphatase inhibitor) 常用濃度為 20 mM Na₂P₂O₄。

如何萃取蛋白質

蛋白質樣品來源有很多種，包含細胞、動植物組織、微生物，各種樣品的對應不同的樣品處理方式，以下提供通用的萃取步驟，使用者可依照實驗需求做調整。

一、細胞蛋白萃取

(1) 將細胞培養盤置於冰上，移除培養液

(2) 以冰PBS清洗過一次 (可以使用 ACE Biolabs 10XPBS (C1015) 或是 20X PBS Buffer (C1037) 稀釋)。

(3) 再加入適量的裂解液 ACE Biolabs 1X RIPA Lysis Buffer (C1020)，均勻混合。(6 Well 大約每格加100 ul 裂解液)

(4) 使用超聲波振盪器將細胞裂解

(5) 使用4℃離心機，以轉速12000g，離心20分鐘

(6) 收集上清液，存於-20℃或-80℃

蛋白質裂解液配方：25 mM Tris-HCl pH7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS.

二、動物組織蛋白萃取

(1) 將組織加入適量的裂解液ACE Biolabs 1X RIPA Lysis Buffer (C1020)，以乾淨剪刀將組織剪碎。

(2) 使用均質機與超聲波振盪器將組織裂解

(3) 使用4℃離心機，以轉速12000g，離心20分鐘

(4) 收集上清液，存於-20℃或-80℃

蛋白質裂解液配方：25 mM Tris-HCl pH7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS.

三、植物組織蛋白萃取

由於植物具有堅硬的細胞壁,可以再研磨過程中加入石英砂幫助打破。此外，許多植物有含酚化合物，在空氣中很快氧化成褐色色素，可以裂解液中加入polyvinyl pyrrolidone（PVPP）。PVPP為一種不溶於水的高分子聚合物，可透過氫鍵吸附多酚，並藉由離心去除干擾物質。

(1) 將樣品及石英砂放入研缽中以液態氮研磨，研磨後加入裂解液（1g樣品約加入3.5ml裂解液）於冰上靜置3小時。

(2) 使用4℃離心機，以轉速12000g，離心20分鐘

(3) 收集上清液，存於-20℃或-80℃

植物組織蛋白質裂解液配方：1 M Tris-HCl（PH8） 45ml, Glycerol 75ml, Polyvinylpolypyrrordone 6g, 補水至300 ml

四、核質分離萃取套組

若您需要進一步分析某種蛋白質在細胞核和細胞質的含量，您可以選擇使用ACExtract Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit (CE1017)。透過細胞質試劑 A 和 B，在低滲透壓條件下，使細胞充分膨脹後破壞細胞膜，釋放出細胞質，透過離心得到細胞核沉澱。最後透過高鹽的細胞核蛋白抽取試劑得到核蛋白。萃取得到的蛋白質為非變性，有活性，可用於Western blot、EMSA、footprinting、報告基因檢測以及酶活性檢測等後續操作。

蛋白樣品製備注意事項

1. 盡速處理樣品，若需置放一段時間，需存於-20℃ 或-80℃

2. 需了解樣品特性，找出最適合的樣本製備方法，避免蛋白質未萃取完全，造成誤差。

3. 保持低溫、添加蛋白抑制劑100X Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free) (ACE Biolabs, A1029)及磷酸酶抑制劑100X Phosphatase Inhibitor Cocktail (A+B) (ACE Biolabs, A1029)，儘可能減少樣品蛋白質降解。

4. 透過離心並小心取出上清液，完全去除非蛋白質物質。

5. 將樣品分裝存於-20℃或-80℃，勿反覆解凍樣品。

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