Cell culture | 細胞汙染防治與清潔 2019/11/13

細胞汙染防治與清潔

細胞汙染是細胞培養最嚴重的問題，不僅會影響細胞生長速度，更嚴重的會造成細胞型態的差異，最後，就是使細胞死亡。對於細胞培養新手來說，細胞汙染是一大威脅，時常會花很久的時間來找出汙染原因，但是，在此期間汙染可能會不段擴大。相信每間實驗室或多或少都發生過細胞污染的情形，即使再小心翼翼，也總會有”意外”發生的時候。

如何預防細胞汙染--

• 確認器具的清潔：

開始細胞培養前，所有會接觸到細胞的藥品、耗材或器具等，都必須是無菌的。

1. 培養基（Medium）

選擇符合細胞的培養基固然重要，然而，培養基的乾淨程度是最直接影響細胞生長的，因此，培養基的配置方式是非常重要的，以下為ACE Biolabs 提供的方法：

• 若購入之基本培養基(basal medium)為粉末包裝，建議於配置兩天前，將血清瓶以一次水清洗三次、二次水清洗三次，於瓶口包覆鋁箔紙並貼上滅菌膠帶(寫上日期)，高溫高壓滅菌完成後置於烘箱烘乾。配置基本培養基所使用的二次水，建議當日取用純水機所製造出來的二次水，以確保水源乾淨。粉末狀的基本培養基以二次水完全溶解後，需確認其pH值為7.2-7.4，接著在無菌操作台中以0.22 μm 濾杯(Thermo, 500 mL, 595-4520)過濾培養基至無菌血清瓶中。 完成後，取2 mL 基本培養基至3.5 cm 無菌培養皿中，存放於一般細胞培養環境(37°C, 5% CO2)中三天以上，每天觀察培養基狀態。若培養基變混濁或顯微鏡下觀察到雜質或微量的菌即為有汙染，需重新過濾或是捨棄該批培養基並且將環境重新清潔乾淨。

• 基本培養基(basal medium)加入血清後，也需要取2 mL培養基，至3.5 cm 無菌培養皿中，存放於一般細胞培養環境(37°C, 5% CO2)中三天以上，每天觀察培養基狀態。若培養基變混濁即為有汙染，顯微鏡觀察下若發現雜質但是不會動或增加，屬正常現象。血清含有很高的營養物質，會讓細菌快速繁殖，造成細胞汙染，所以培養基無菌測試建議放三天以上，確認medium澄清再進行使用。
   
• 無菌測試所取用的2 mL培養基，需存放於細胞培養環境，直到此瓶培養基完全使用完皆為澄清，表示此瓶培養基配置過程是乾淨無菌的。

2. 血清

血清長久保存需要存放於-80oC ，購入時通常是500 mL或1 L的包裝，對於大體積包裝，建議可以分裝使用。一般細胞培養所用的血清都已經經過0.1μm過濾處理，肉眼可見的懸浮物為蛋白質沉澱，可用離心或0.45 μm 過濾去除。血清解凍應該於4˚C 緩慢退冰，約需要1-2天，千萬不要直接拿去37˚C 回溫，過大的局部溫差變化會導致大量沉澱產生，降低營養成分。

3. 耗材/耐高溫器皿

耗材類的物品都需要以高溫高壓滅菌（通常為121˚C, 30 min）並放60˚C烘箱烘乾。可滅菌的器具，例如：血清瓶、燒杯等，也可用高溫高壓滅菌來達到無菌的效果。

4. 藥品

細胞實驗最常用的藥品不外乎就是1x PBS、Trypsin或是抗生素。ACE Biolabs 提供10x sterile PBS （C1015, ACE），只需要以無菌水稀釋至1x即可使用；Trypsin和抗生素通常包裝即為無菌，以自己需要的濃度稀釋即可。用於細胞實驗的藥物待完全溶解後，以0.2μm的filter過濾液體，以達到無菌的效果，若是非無菌情形下配置的PBS，可以直接以高溫高壓滅菌或是0.2μm的filter過濾。

• 無菌操作注意事項：

細胞室操作首先要注意的就是「保持乾淨」，細胞室的設備最好都是細胞專用，包含離心機、自動吸量管 (autopipette)、微量吸管 (pipetman) 等，避免和細菌實驗共用設備而導致汙染。需要特別注意細胞操作檯、細胞培養箱和二氧化碳鋼瓶。

1. 進入細胞房後，先戴上手套，以75% 酒精擦拭後才開始進入操作檯操作。過程中若有移動到外面，接觸操作檯以外物品，皆需要以75% 酒精擦拭，保持乾淨。
2. 細胞房定期以稀釋的漂白水、次氯酸水或是生物實驗室專用的去汙染消毒噴劑 (CE1024 ACEcleaner Disinfectant Spray) 擦拭操作檯外面桌面和地板（建議每週1-2次），若細胞是裝有UV燈，每週至少一次開啟細胞房 UV，照射消毒一個晚上。
3. 細胞培養箱的水盤需要定期清理（建議每週一次），並加入水浴槽抑黴劑(CE1023 ACEcleaner Disinfectant Concentrate)。
4. 恆溫水槽需要定期清理（建議每週一次），並加入水浴槽抑黴劑(CE1023 ACEcleaner Disinfectant Concentrate)。

細胞操作會在「生物安全操作檯 (Biological Safety Cabinet, BSC) (class II)」進行，和一般的「化學抽氣櫃」或「無菌操作檯」不同。化學抽氣櫃是負壓，避免化學物質滲透到外面空氣中；而無菌操作檯則是正壓，由外界吸入空氣，經由高效率過濾網 (HEPA) 過濾後，將乾淨的空氣送出，避免外在空氣微生物進入。生物安全操作檯是內循環系統，由外界吸入並過濾的空氣，會在操作檯前後兩端被吸入，並不會流到外面，因此操作檯內外的空氣完全隔離。這樣的好處在於除了可避免外界微生物進入汙染，同時也可以避免內部感染性生物 (如病毒) 暴露到外界。而維持穩定的氣流需要控制拉門在特定高度，過高或高低皆會導致氣流不穩定，影響安全狀態。比較舊型的生物安全操作檯沒有自動化系統，必須由人力判斷高度，通常會在拉門下緣貼上一張紙條，正確的高度會讓紙條水平浮起。新型的操作檯會自動偵測，錯誤的高度會使系統發生警報聲，因此較容易判斷。

1. 操作檯開始使用前，先以75% 酒精擦拭平面，將會使用到的培養皿、微量吸管或tip等放入，開啟UV燈照射15分鐘以上，再讓風扇運轉10分鐘以上，使氣流穩定。
2. 所有實驗用品都必須先以75% 酒精擦拭過，才能放入操作檯裡面。
3. 裡面物品的擺放不應過度壅擠而阻擋氣流的流動，如果有很多實驗，應該分階段移入物品，不要一次全部移入。
4. 取用無菌溶液和操作細胞時，打開蓋子後應盡快蓋回，並且在開蓋過程中，盡量避免瓶蓋或手經過上方。
5. 實驗完畢後，以75% 酒精擦拭平面，並開啟 UV 照射半小時以上。
6. 一些常用室溫物品可以放置於操作檯裡面，如自動吸量管、微量吸管、吸管 (tip)、管子架子等，但要應避免塑膠類物品受 UV 長時間照射，造成塑膠老化 (每次使用完照射半小時即可)。
7. 注意氣流壓力，定期更換紫外線燈管和過濾網。

如何觀察細胞汙染-- 

• 細胞汙染情形： 

細胞最常見的汙染為細菌或真菌汙染，會造成培養基混濁、細胞死亡，但因肉眼可見明顯變化，所以容易被察覺，最可怕的是那些不易被察覺的汙染源，例如：黴漿菌。

• 平時觀察細胞是否汙染

1. 觀察medium有無變混濁。
2. 觀察medium是否很快變黃
3. medium中通常都有加入酚紅，依據酸鹼值變化會有不同顏色，方便細胞培養時掌握細胞養份是否足夠，若medium很快變黃，但細胞卻沒有滿盤，表示medium中的養份是被汙染源吃掉了，會使細胞得不到養份而逐漸死亡。
4. 以顯微鏡觀察細胞生長速度或形態是否正常。
5. 通常真菌或細菌汙染都很容易會被發現，但是黴漿菌卻是無法用顯微鏡觀察出來的汙染源。黴漿菌會貼附在細胞表面，與細胞共生存，到了後期會改變細胞外觀，影響其基因表現。
6. 每次擴盤前皆取1 mL medium，定期或有疑慮時檢測黴漿菌。

• 發現細胞汙染，首先要做的是?

1. 將汙染的細胞與乾淨的細胞隔絕，避免汙染擴大。
2. 重新取2 mL培養基至3.5 cm 無菌培養皿，做無菌測試。(即使一開始的無菌測試是乾淨的，也有可能在使用過程中被汙染。)
3. 進行黴漿菌檢測 (CM1001 Mycoplasma Detector)。

• 如何確定被什麼汙染？

1. 細菌汙染：Medium混濁變黃，肉眼可見。在顯微鏡底下可看見移動或原地抖動的黑色圓點，會貼附在培養皿上，競爭細胞生存空間與養份，一般可用抗生素抑制。若要確定是否為細菌汙染，可吸取上清液用agarose培養，觀察是否形成菌落。
2. 黴菌汙染：Medium澄清，顯微鏡底下無雜質，在細胞培養箱2-3天會出現絮狀雜質，可見明顯菌絲，會使細胞活性減低。若要確定是否為細菌汙染，可吸取上清液用agarose培養，觀察是否形成菌落。
3. 黴漿菌汙染： Medium澄清，顯微鏡觀察不到，初期與細胞共生共存。黴漿菌會貼附於細胞表面，漸漸影響細胞基因表現，後期則會改變細胞型態。黴漿菌汙染難以察覺，通常要到後期，細胞型態改變才會發現。ACE Biolabs 提供方便、快速的黴漿菌檢測試劑(CM1001 Mycoplasma Detector)，只需要1 μL培養細胞後的medium，一小時後即可知道是否汙染。抗生素對其無效。
4. 黑膠蟲汙染： Medium澄清，顯微鏡低倍率觀察底盤乾淨，200-400x可觀察到抖動的小黑點，會懸浮在medium中，與細胞共生。目前黑膠蟲汙染尚有爭議，一部分人認為黑膠蟲是存在於牛血中的原生生物（似草履蟲），另一部分人認為，這只是細胞脆片或是血清中蛋白質的布朗運動。抗生素對其無效。

• 確定汙染源後的處理方法：

無論汙染源為何，為了避免汙染擴大，都需要徹底清理細胞室。

1. 無菌操作台、incubator、恆溫水槽、顯微鏡等，都需要以稀釋後的漂白水擦拭後再以75%酒精擦拭，整個細胞室都需要仔細清潔。若為黴菌汙染，須用硫酸銅水容液擦拭。
2. Incubator中的層板、鐵架、水盤皆須要拆下來清潔，依照以下順序進行清潔：稀釋後的漂白水擦拭三次、無菌水擦拭三次、75%酒精擦拭三次。若細胞室有UV燈可以將層板、鐵架與水盤放置桌上開UV燈，無UV燈則放入無菌操作台照UV。
    

不同汙染源之解決方法：

1. 細菌、黴菌、真菌汙染：清除全部被汙染細胞，清潔所有器具以及環境，並確認所使用培養基為無菌後，方可重新解凍細胞。
2. 黴漿菌汙染：抗生素對黴漿菌無效。對付黴漿菌需使用其專用的抑制劑(CM1003 Mycoplasma Cleaner)。每次更換培養基時皆須加入黴漿菌抑制劑，並取1 μL檢驗黴漿菌殘留，直到未再檢出黴漿菌。
3. 黑膠蟲汙染：黑膠蟲稱Nanobacteria，抗生素對其無效，目前無公認有效的根除方法，只能利用其會懸浮在培養液中的特性，在每次擴盤時以重複離心、PBS清洗的方式減少黑膠蟲汙染。
    

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參考資料

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC20966/

https://kknews.cc/zh-tw/home/jm4392y.html

https://world.taobao.com/item/558247677546.htm

https://www.hanbio.net/cn/articles/item/430281

http://zfdows.com/h-pd-195.html